明暗箱(黑白箱)實驗--ICR焦慮癥小鼠的抗焦慮研究
據統計，我國每年有大約7000萬病人接受手術**。然而，隨著快速康復外科等理念的提出，患者術后疼痛、惡心嘔吐已被較好的控制，但外科及麻醉科醫師常常忽略了患者術前焦慮。據報道，患者行擇期手術術前焦慮的發生率可達80%，而在近期我國的一項多中心研究也發現患者高度焦慮的發生率高達25.9%。
焦慮癥(Anxiety disorder)是較為常見的一種以焦慮、緊張等焦慮情緒為主的神經癥，多呈陣發性或者持續性發作。有研究發現術前焦慮不僅可增加術中、術后對啊片類**的需求，從而增加術后并發癥，甚至增加某些手術術后的死亡率和發病率，并且可延緩乳腺癌患者術后的恢復。此外，一項前瞻性隊列研究認為全髖關節置換術患者術前焦慮HADS-A評分大于7分可明顯增加患者術后發生譫妄的發生率，且可以以**術前焦慮為切入點從而減少術后譫妄。更值得一提的是，術前明顯焦慮的患者渴望可以得到醫師積極的支持**。因此，如何更好診治術前焦慮癥成為亟待解決的問題。
目前心理**和****是常用來**焦慮癥的方案。心理**周期很長且主觀和客觀因素對其影響較大。而****目前也存在許多的**反應及局限性，如引起認知功能損害、肝功能損害、產生**依賴與軀體戒斷狀態等。那么是否有更多的方法來促使患者術前焦慮狀態得以緩解呢?
術前飲食療法對**或緩解患者術前焦慮鮮見相關報道。稻谷籽粒中的大米胚芽是一種富含蛋白質、脂肪、多種維生素以及礦物質的大米加工副產品，重量約占稻谷的2%~2.2%，占糙米的2.6%~2.9%。其中蛋白質含量達22.5%上，尤其是人體必需氨基酸苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸*多，B維生素含量也相當豐富且以維生素B1、維生素B2和尼克酸為主。日本三枝等發現大米胚芽中含量豐富的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)約為0.3%，并且大米胚芽可通過自身脫梭酸的反應快速大量地產生。富含γ-氨基丁酸的大米胚芽對**、抑郁癥、植物神經紊亂有一定的作用，而大米胚芽的抗焦慮作用鮮見報道。
因此，本課題將建立小鼠焦慮模型，并運用明暗箱實驗初步探討大米胚芽粉對小鼠的抗焦慮作用。該實驗結論有望為外科手術患者術前飲食或者診療方案提供建議，并為臨床焦慮癥患者診療提供新的思路。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1動物:健康雄性ICR小鼠99只，4周齡，清潔級，體質量16~20g，由福建醫科大學實驗動物中心提供。室溫(20±2)℃，濕度40%~70%，光照12h(6∶00~18∶00)和黑暗12h(18∶00~6∶00)環境。動物飼養于標準飼養籠內，每周換籠2次，飼養3周后進行實驗。自由飲水攝食，預適應環境3d后，稱重并隨機分組進入正式實驗。
1.1.2藥品與試劑:無菌生理鹽水(500mL);D西泮注射液，臨用前打開，用生理鹽水配制成2mg·kg-1 D西泮溶液;
1-(3-氯苯基)哌嗪單鹽酸鹽(1-(3-chlorophenyl)piperazine monohydrochloride，MCPP)，臨用前稱重將粉末溶于生理鹽水，配制成0.005%，0.01%，0.02%，0.04%MCPP溶液;75%醫用酒精;米胚粉，與正常飼料混合制成高劑量(含40%大米胚芽粉)、中劑量(含10%大米胚芽粉)、低劑量(含2.5%大米胚芽粉)飼;儀器明暗箱(LDB):由黑色和透明亞克力板制成，包括三部分:較大部分2/3為明箱區，上方有透明頂蓋，較小部分1/3為暗箱區，上方有黑色頂蓋，兩箱體隔板正中央有通道。距離地面2m處放置攝像機，記錄小鼠在明暗箱的行為。
1.2方法
1.2.1建立ICR小鼠焦慮模型:正常雄性ICR小鼠35只，按體重隨機分為5個組(生理鹽水組，MCPP0.25mg·kg-1組，MCPP0.50mg·kg-1組，MCPP1.00mg·kg-1組，MCPP2.00mg·kg-1組)，每組7只，各組均自由飲水攝食，飼養一周后于第8天8∶00~14∶00進行明暗箱實驗。所有小鼠均應于實驗前一日運送到行為學實驗室，適應環境，減少動物緊張。每只小鼠實驗前20min按體重(5mL·kg-1)進行腹腔注射，生理鹽水組注射無菌生理鹽水，4個劑量組分別注射0.25mg·kg-1，0.50mg·kg-1，1.00mg·kg-1，2.00mg·kg-1的MCPP溶液，腹腔注射完成后20min依次進行明暗箱實驗。
將小鼠放入暗箱正中，頭部對著通道口方向，迅速蓋上蓋子，觀察5min。觀察指標包括:明箱停留時間以及明箱與暗箱之間的穿梭次數，其中小鼠在明暗箱中一次探索行為的開始或結束的標準是:以小鼠四足完全進入明箱或暗箱。測試前將每只小鼠放入一個35cm×10cm×5cm籠中，任其自由探究5min后，迅速將小鼠從籠內取出(小鼠背向實驗者)，放置在實驗裝置中，打開攝像系統，記錄小鼠在實驗裝置內的活動，時間為5min;*后，實驗結束后將小鼠放回籠內，**留在裝置上的糞便和尿液，并用75%醫用酒精溶液擦拭，待酒精揮發完全或用干布擦干后再進行下一只小鼠的測試。
1.2.2探討米胚粉對小鼠焦慮癥的作用:正常雄性ICR小鼠50只，按體重隨機分為5個組，每組7~11只，即MCPP1.0mg·kg-1組、陽性對照藥D西泮組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各組均自由飲水攝食，于第8天8∶00~14∶00做明暗箱實驗(方法同上)。陽X藥D西泮組需在實驗前30min先行腹腔注射D西泮溶液(2mg·kg-1)，所有動物在實驗測試前20min按體重(5mL·kg-1)分別腹腔注射1.00mg·kg-1MCPP溶液。
1.2.3中劑量米胚粉對正常ICR小鼠的影響:正常雄性ICR小鼠14只，按體重隨機分為2個組，每組7只，即生理鹽水組、中劑量組，中劑量組喂食中劑量米胚粉，各組均自由飲水攝食，于第8天8∶00~14∶00做明暗箱實驗(方法同上)。兩個劑量組在實驗前20min按體重(5mL·kg-1)分別腹腔注射無菌生理鹽水溶液，觀察5min。
1.3統計學處理根據實驗過程中記錄的詳細數據資料，進行統計學處理，數據處理用單因素方差分析(ANVOA)進行多組間比較，兩組間采用t檢驗，數值采用x±s表示，P＜0.05為差別有統計學意義。
2結果
2.1不同劑量MCPP對ICR小鼠明暗箱實驗的影響用不同濃度的MCPP往小鼠腹腔注射后，讓小鼠在明暗箱中自由探索，檢測小鼠在明箱停留時間和穿梭次數。結果顯示與生理鹽水組相比，0.25mg·kg-1，0.50mg·kg-1，1.00mg·kg-1，2.00mg·kg-1的MCPP溶液均能夠減少小鼠在明箱停留時間，但是只有MCPP1.00mg·kg-1劑量組對小鼠明箱停留時間有統計學差異(P＜0.05)，其余劑量組無統計學差異(P＞0.05)，各劑量組未呈現出劑量--反應關系，而呈現出平緩的“u”型曲線。與生理鹽水組相比，MCPP0.25mg·kg-1、0.50mg·kg-1劑量組對小鼠穿梭次數都有統計學差異(P＜0.05);而MCPP1.00mg·kg-1劑量組對小鼠穿梭次數統計學差異更顯著(P＜0.01);MCPP2.00mg·kg-1劑量組無統計學差異(P＞0.05)。綜上所述，明暗箱致焦慮模型造模成功，MCPP1.00mg·kg-1劑量組統計學差異更顯著，致焦慮模型的效果更明顯，所以MCPP1.00mg·kg-1為小鼠明暗箱致焦慮模型實驗*適濃度(見圖1)。
2.2不同劑量米胚粉對ICR小鼠明暗箱實驗的影響用MCPP1.0mg·kg-1往小鼠腹腔注射后，讓小鼠在明暗箱中自由探索，檢測小鼠在明箱停留時間和穿梭次數。結果顯示與MCPP1.0mg·kg-1組相比，低、中、高劑量組均能夠增加小鼠在明箱停留時間，但只有中劑量組對小鼠明箱停留時間有統計學差異(P＜0.05)，D西泮組對小鼠明箱停留時間統計學差異更顯著(P＜0.01)，低、高劑量組對小鼠明箱停留時間均無統計學差異(P＞0.05)，三個劑量組未呈現出劑量--反應關系，卻呈現出神經藥理實驗特有的鐘型曲線。與MCPP1.0mg·kg-1組相比，D西泮劑量組對小鼠穿梭次數有統計學差異(P＜0.05)，其余三個劑量組對小鼠穿梭次數均無統計學差異(P＞0.05)。綜上所述，雖然中劑量組只增加小鼠明箱停留時間，幾乎與D西泮組相當，未增加穿梭次數，但是明暗箱實驗中明箱停留時間對小鼠焦慮作用效果優于穿梭次數，所以中劑量米胚粉有一定的抗MCPP所致的小鼠焦慮癥狀(見圖2)
2.3中劑量米胚粉對正常ICR小鼠明暗箱實驗的影響結果用無菌生理鹽水往小鼠腹腔注射后，讓小鼠在明暗箱中自由探索，檢測小鼠在明箱停留時間和穿梭次數。結果顯示與生理鹽水組相比，中劑量組對小鼠明箱停留時間和穿梭次數均無統計學差異(P＞0.05)，所以中劑量米胚粉與生理鹽水在明暗箱實驗中停留明箱時間和穿梭次數無明顯區別，表明中劑量米胚粉對正常小鼠無致焦慮作用(見圖3)。
3討論
明暗箱實驗是測試小鼠是否焦慮的經典實驗，可反應小鼠的活動度以及焦慮情緒。本實驗采用明暗箱實驗觀察小鼠的焦慮行為，從而判斷小鼠是否發生焦慮癥狀。相關實驗指標的觀察與計算主要依靠實驗者來人工操作，會因為實驗者的主觀性而產生結果偏倚，后期實驗室將配備實驗動物視頻行為分析系統，來提高焦慮動物實驗自行處理實驗結果的能力和效率，還能觀察計算許多人工無法觀測的指標。
在小鼠致焦慮模型明暗箱實驗中，MCPP1.00mg·kg-1劑量組對小鼠明箱停留時間和穿梭次數都有統計學差異，而且與其他劑量組相比差異更顯著，致焦慮模型效果更好，說明明暗箱致焦慮模型造模成功，因此可以選用MCPP1.00mg·kg-1為小鼠明暗箱致焦慮模型實驗的*適濃度。本實驗在致焦慮模型建立過程中表現出了有效性、可靠性、實用性，因此繼續選用明暗箱致焦慮模型實驗的*適濃度，對小鼠進行造模產生焦慮癥狀，探討大米胚芽粉對抗MCPP所致焦慮癥的作用。根據實驗結果分析，雖然中劑量組對小鼠明箱停留時間有統計學差異，而對穿梭次數無統計學差異，但是明暗箱實驗中明箱停留時間對小鼠焦慮作用效果優于穿梭次數，其中中劑量的作用效果略遜于D西泮，顯示中劑量大米胚芽粉對小鼠焦慮行為有確切的**作用，所以中劑量米胚粉有一定的抗MCPP所致的小鼠焦慮癥的作用。在實驗中各劑量組并未出現相應的劑量--反映關系，呈現出神經藥理實驗特有的鐘型曲線，說明米胚粉在抗MCPP所致的小鼠焦慮癥狀中，并不是劑量越高越好，初期可能抗焦慮效果隨著劑量的增加而提高，達到頂峰后，隨著劑量的增加效果逐步下降，可能趨于穩定，亦或是米胚粉自身有致焦慮作用，所以進行下一步中劑量米胚粉對致焦慮的實驗。實驗結果表明:與生理鹽水組一樣，中劑量組注射生理鹽水后對小鼠明箱停留時間和穿梭次數均無統計學差異，所以中劑量米胚粉與生理鹽水在明暗箱實驗中停留明箱時間和穿梭次數無明顯區別，表明米胚粉無致焦慮作用。明暗箱實驗結果假陽性可能性大，因此評估需結合運動功能。明暗箱實驗中一般抗焦慮劑會增加明暗箱明箱行為活動;而致焦慮劑則相反。通過明箱停留時間百分率來反映抗焦慮療效，因此焦慮程度與明箱停留時間百分率成反比。
文章來源：福建醫科大學附屬協和醫院/福建醫科大學公共衛生學院 劉培昌，馬小賓等老師所發表的《探討大米胚芽粉對 ICR 焦慮癥小鼠的抗焦慮作用》，文章編號: 1006-3765( 2021) -10-0016-05
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